Montag, 01 Oktober 2018 21:39

Neues vom EUSAAT-Kongress in Linz Empfehlung

Mit rund 290 Teilnehmern aus 29 Ländern ist der Kongress der European Society for Alternatives to Animal Testing (EUSAAT) der größte Kongress zum Thema 3R in Europa und erfreut sich zunehmender Beliebtheit. Mit 169 Vorträgen und 100 Postern informierten Wissenschaftler und Wissenschaftlerinnen über die neuesten Entwicklungen auf dem Gebiet der 3R (replacement, reduction und refinement von Tierversuchen).



Linz-City.
Foto: Pixabay.


Der Bereich der neuen tierversuchsfreien Methoden stand vor allem im Zeichen von Organ-on-a-Chip-Entwicklungen, der Gestaltung von Krankheitsmodellen und des 3D-Gewebedrucks. In einer Keynote informierte Dr. Reyk Horland von TissUse über die erfolgreiche Entwicklung eines humanen Knochenmark-Gewebemodells auf dem Chip, mit dem Effekte von Substanzen auf das Knochenmark untersucht werden können. Ein Diabetes Typ 2-Modell kombinierte menschliches Leber- und Pankreasgewebe. Hiermit konnte der Crosstalk zwischen den beiden verschiedenen Gewebetypen bewiesen werden. Das Berliner Start-up, eine Ausgründung der Technischen Universität Berlin, stellte zudem den 4-Organ-Stoffwechselchip vor, der über zwei Kreisläufe Blutsurrogat und Exkretion organisiert. TissUse verfügt mittlerweile über eine kleine Zellbank mit induzierten pluripotenten Stammzellen, aus denen organähnliche Systeme entwickelt werden können. Für einen angestrebten 12-Organ-Chip brächte das Unternehmen jedoch Zellen bzw. Gewebe von einem Spender, um Abstoßungsreaktionen zu vermeiden. Es wird angestrebt, später Robotersysteme mit 24 12-Organ-Chips als Testanlagen anbieten zu können. Jede Robotereinheit wird dann einen Medienwechsel automatisch vornehmen.


Reger Austausch von Wissenschaftlern auf dem Linzer Kongress 2018.
Foto: C. Hohensee



Kevin Achberger aus der Arbeitsgruppe von Prof. Peter Loskill vom Fraunhofer Institut für Grenzflächen und Bioverfahrenstechnik hat Retina-Organoide auf dem Chip entwickelt. Als Grundlage wurden humane Keratinozyten genutzt, wie sie z.B. aus Haarzellen gewonnen werden können. Es konnten alle für die Retina notwendigen Zelltypen erzeugt werden und z.B. Reaktionen der ausgebildeten Photorezeptoren auf Licht gemessen werden.

BASF führt seit Längerem sogenannte Metabolom-Analysen zur Beurteilung der Toxizität durch. Anstelle von Versuchstieren hat das Unternehmen in einer Untersuchung die Eignung der Nierenzelllinie NRK-52e der Ratte getestet, die im Rahmen eines BMBF-Förderprojekts entwickelt worden war. Die Zelllinie könnte geeignet sein, Substanzen auf Nierentoxizität zu screenen, andererseits helfen, den Mechanismus zu verstehen, der bei der Entwicklung der Nierentoxizität abläuft (Mode of Action).

Daniel Seitz von der Universität Bayreuth beschäftigt sich mit Biokompatibilitätstests von Knochenimplantaten. Da die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Implantat und Knochenmaterie in Versuchstieren völlig irrelevant ist und zu falschen Ergebnissen führt, hat er einen in-vitro-Assay mit humanen Zelllinien entwickelt. Der in-vitro-Test enthält Knochen-aufbauende und Knochen-abbauende Zellen (Osteoblasten und Osteoklasten) sowie eine Stromazelllinie, mit denen Mineralisierung und Gefäßentwicklung- und invasion (Aufbau) sowie Resorption (Abbau) als Reaktion auf das Implantat untersucht werden können. Zur Untersuchung der Gefäßinvasion wird ein modifizierter HET-CAM-Test verwendet. Das Material ist derzeit noch nicht standardisiert.

Prof. Arti Ahluwalia von der Universität Pisa hat sich mit der kritischen Sauerstoffversorgung von Organoiden des Mittelhirns beschäftigt. Es ist bekannt, lokaler Sauerstoffmangel bei Organoiden zu einem nekrotischen Zentrum führt, das Gewebe bzw. Zellfunktion beeinträchtigt. Daher hat sie Computermodelle mit Bildern reifer Organoide aus Zellen des Mittelhirns kombiniert, um die minimale Sauerstoffkonzentration zu ermitteln, die für die Lebensfähigkeit der Zellen notwendig ist. Die Zellen waren aus menschlichen neuroepithelialen Stammzelllinien abgeleitet.

Neue Krankheitsmodelle

Die Arbeitsgruppe um den Jenaer Wissenschaftler Dr. Alexander Mosig informierte über ein Leberinfektionsmodell mit dem Bakterium Staphylococcus aureus. Ein Lungen- und Lebermodell für Infektionsstudien stellte Nachwuchswissenschaftlerin Johanna Berg von der Technischen Universität Berlin vor. Die Zellen wurden mit dem 3D-Drucker gedruckt und verschiedene biokompatible Stoffe z.B. auf ihre Eignung als extrazelluläre Matrix hin untersucht, für Entzündungsbotenstoffe durchlässig zu sein.

Ein Forscherteam um Prof. Buttgereit befasst sich mit der Nachbildung eines Gelenks zur Untersuchung von Arthritis oder damit verbundenen entzündlichen Gelenkerkrankungen. Die Nachwuchswissenschaftlerin aus dem Team, Alexandra Damerau, stellte die erfolgreiche Kultur von Knochen- und Knorpelgewebe vor, das aus humanen mesenchymatischen Stammzellen entwickelt worden war. Zusätzlich gelang es der Forscherin, eine passende Gelenkflüssigkeit aus Hyaloronsäure zu erzeugen sowie die zugehörige Gelenkhaut. Die Bestandteile sollen zu einem dreidimensionalen Mehrkomponenten-Fugenmodell zusammengesetzt werden, mit dem Ziel, Pharmazeutika zu testen.

Aus demselben Team stellte Moritz Pfeiffenberger ein Knochenheilungsmodell vor, mit dem die Anfangsphase der Frakturheilung simuliert werden kann. Es besteht aus dreidimensionalen Knochenkonstrukten, gewonnen aus humanen mesenchymalen Stammzellen, und einem Frakturhämatom, bei dem menschliches peripheres Blut und mesenchymale Stromazellen (MSCs) zusammen koagulierten. Das Modell kann teilweise Prozesse der Anfangsphase der Frakturheilung nachzuahmen, so dass es für präklinische Tests von Arzneimitteln zur Unterstützung der Knochenregeneration genutzt werden kann.

Dr. Johannes Grillari vom Institut für Biotechnologie der Universität Wien hat ein Seneszenzmodell der Haut entwickelt. Im Alter nimmt die Schichtdicke der Haut ab. Ein Fokus der Untersuchungen liegt dabei auf einzelnen Zellen, die die Alterung der sie umgebenden Zellen triggern. Entfernt man diese Zellen, lässt sich der Alterungsprozess aufhalten. Ein weiterer Fokus liegt auf der Untersuchung von Pflanzenextrakten, die diesem Alterungsprozess entgegenwirken können. In Untersuchungen hat sich gezeigt, dass sich der Alterungsprozess mit einem alkoholischen Auszug von Solidago alpestris rückgängig machen ließ.
Wissenschafter von der Universität Würzburg haben in-silico-Modelle entwickelt, um zum Verständnis von molekularen Mechanismen des adrenokortikales Karzinoms der Niere bzw. von Lungentumoren beizutragen und neue Behandlungsmethoden zu entwickeln.

Mit in-vitro-Dünndarmmodellen untersuchen Dr. Jan Markus und Kollegen von MatTek die Weizenproteinunverträglichkeit und die Arzneimittelabsorption.

Katharina Hörst von der Arbeitsgruppe von Prof. Sarah Hedtrich an der Freien Universität Berlin stellte ein interessantes Projekt vor. Narbengewebe (Myofibroblasten) lassen sich in Fettgewebe (Adipozyten) umwandeln. Eventuell lässt sich später einmal bei der Wundbehandlung die Narbenbildung verhindern.

Einfach oder kompliziert?

Hinsichtlich der Forschungen von Organ-on-a-Chip-Entwicklungen werden zwei Richtungen verfolgt: Zum einen versuchen Wissenschaftler, die Modelle so einfach wie möglich zu halten, damit sie leicht und kostengünstig herzustellen und im Hochdurchsatz praktisch anwendbar sind. Hierfür wird derzeit die Organoidform z.B. in der Hanging-drop-Kultur in 96 Well-Format als favorisiert, z.B. beim Schweizer Unternehmen InSphero.

Dr. Muneef Ayyash von der Firma Tissue Dynamics in Jerusalem und vom Grass Center for Bioengineering, Jerusalem stellte eine Organ-on-a-Chip-Plattform in integrierten Sensoren vor. Herkömmliche Tests konzentrierten sich zu sehr auf die Endpunkte und Biomarker-Assays, vernachlässigten aber den Grund für Gewebeschädigungen. Hierdurch würden unerwünschte Wirkungen unterhalb der toxischen Schwelle leicht übersehen und auf wichtige Informationen verzichtet. Deshalb werde hier mit mikrosensorintegrierten Organ-on-a-Chip-Anordnungen gearbeitet, um zusätzliche Hinweise auf die Zellreaktionen zu erhalten.  

Andere Wissenschaftler arbeiten daran, die Modelle dem menschlichen Organ immer näher kommen zu lassen. Dafür ist eine technologische Entwicklung wichtig: die 3D-Bioprinter, da über diese Technologie die benötigten kleinsten Blutgefäße integriert werden können, die für die Versorgung der Organe mit Sauerstoff und Nährmedien notwendig sind.

Organ-on-a-Disk-Systeme

Eine neue Technik hat Prof. Peter Loskill, Leiter der Attract-Gruppe Organ-on-a-Chip beim Fraunhofer-Institut für Grenzflächen und Verfahrenstechnik (IGB) vorgestellt. Seit Team hat Herzgewebe, eine Retina auf dem Chip und weißes Fettgewebe auf dem Chip entwickelt. Durch die Integration einer Pumpe in mikrofluidische Systeme zur Versorgung der Zellen und Gewebe können jedoch Scherkräfte wirken. Deshalb versuchen Wissenschaftler, neue, möglichst schonende Verfahren zu entwickeln, um die Zellen oder Gewebe mit Nährlösung und der Testsubstanz zu versorgen. Die Forscher nutzen eine Scheibe als Chipplattform, die kleinste Kanälchen wie Speichen an einem Rad hat. Dort werden jeweils die Zellen untergebracht. Zentral auf der Scheibe sind kleine Kammern, in denen sich die Nähr- und Testlösungen befinden. Über leichte Rotationen gelangen die Lösungen mit Hilfe der Zentrifugalkraft zu den Zellen, wobei die wirkende Kraft unter der der Gravitationsfeldstärke (9,81 N/kg bzw. 9,81 m/s²) liegen soll. Die Organ-on-a-Disksysteme sollen im Hochdurchsatz verwendet werden können.

Technologie der Zukunft: der 3D-Printer

Mittlerweile können kleinste Gefäße mit einem Durchmesser von 10 Mikrometer gedruckt werden, wie Tobias Grix vom Team des Berliner Start-ups Cellbricks informiert. Er stellt ein gedrucktes Modell vor, mit dem kleinste Gallenkanälchen in einem Leberläppchen mittels 3D-Druck ausgeprägt werden konnte.

Neue Methoden für die Aus-, Fort und Weiterbildung

Für die Qualitätssicherung der Aufnahmen kleiner Versuchstiere mit Strahlungsgeräten werden bislang zahlreiche Versuchstiere verwendet, z.B. um herauszufinden, welche Position des Kleintiers unter dem Strahlengerät die beste Lage für eine Aufnahme ist. Um den Tierverbrauch zu reduzieren, entwickeln Wissenschaftler der Universität Hamburg-Eppendorf 3D-Mausphantommodelle. Aus computertomografischen Bildern wurde am Computer zunächst ein CAD-Modell erstellt und mit einem 3D-Drucker ausgedruckt. Marie Wegner vom Uniklinikum Hamburg-Eppendorf stellte die Produktion zweier Mausmodelle vor, wobei derzeit die Genauigkeit der Nachbildung von Skelett- und Weichteilgeweben aus Gips- und Agarosemix, bzw. Olivenölfüllung noch eine Herausforderung ist.

Ein ähnliches Problem hat die Arbeitsgruppe von Prof. Johanna Plendl von der veterinär-medizinischen Fakultät der Freien Universität Berlin. Sie entwickelt den SimulRATor, einen Simulator für das Handling kleiner Versuchstiere in der Ausbildung. Die Modelle sollen mit einem 3D-Drucker produziert werden, müssen jedoch Weichteil-, Knochen und Gefäßeigenschaften aufweisen wie ein richtiges Tier. Deshalb kooperiert die Gruppe derzeit mit der Industrie. Es gibt bereits kommerziell erhältliche Simulatoren für die Ausbildung, die allesamt aber nicht so richtig etwas taugen und eher im Bereich Plastikspielzeug anzusiedeln sind. Dementsprechend schlecht sind die Vorkenntnisse, wenn angehende Tierversuchskundler und technische Angestellte einem Versuchstier Blut aus der Schwanzvene abnehmen, Spitzen setzen etc. Deshalb hat die Forschergruppe eine bundesweite Umfrage unter den Studierenden gestartet und um Auskunft über die Erfahrung mit den bereits bestehenden Modellen gebeten. Außerdem läuft die Phase der funktionellen Bewertungen von Simulatoren durch fachkundige Veterinärmediziner. Nachwuchswissenschaftler Giuliano Mario Corte stellte einen ersten Entwurf eines funktionellen Rattensimulators vor, der mit einem 3D-Drucker angefertigt worden ist. Er befindet sich derzeit aber noch in der Entwicklung.

Juliane Kuhl von der Technischen Universität Hamburg, Institut für Produktentwicklung und Konstruktionsentwicklung stellte ein neues Trainingsmodell zum Ersatz von Kaninchen für das chirurgische Training vor. Um beim Menschen ein Aneurysma (eine krankhafte Aussackung von Blutgefäßen) zu entfernen, wird den Patienten u.a. ein mikrofeiner Draht in das Blutgefäß eingeführt. Diesen Ablauf müssen die Chirurgen beherrschen. Die Wissenschaftlerin stellte den Hamburg ANatomical NEurointerventional Simulator (HANNES) vor. Besteht aus einem Hohlgefäßbaum, in den zur Übung die chirurgischen Geräte eingeführt werden können. Das Material ist patientenspezifisch und basiert auf echten anatomischen Sachverhalten, die mittels bildgebenden Verfahren (CT bzw MRT), CAD und 3D-gedruckt nachgebildet worden sind. Das Institut bietet 25 patientenspezifische Aneurysmen-Modelle an.

Zusätzlich Interessantes

Dr. Andreas Schiwy von der RWTH Aachen, Abteilung Ökosystemanalysen, hat den sogenannten S9-Mix mit Mikrosomen der Rattenleber biochemisch aus humanen Zellen entwickelt. In Deutschland werden pro Jahr 706 Ratten (weltweit mehr als 12.000) zunächst mit Arochlor-1254 und anderen Substanzen vergiftet, um ihnen dann die Lebern zu entnehmen. Die Mikrosomen in den Lebern haben zu dieser Zeit hohe Mengen an Fremdstoff-metabolisierendem Enzym produziert, das für den S9-Mix charakteristisch ist. Er wird z.B. Bakterienzellkulturen für Mutagenitätstests (z.B. Ames-Test) zugegeben, da sie das Enzym nicht selbst bilden können. Der so hergestellte S9-Mix ist zuverlässiger, spezifischer, schneller sowie kostengünstiger. Er ersetzt die qualvolle Vorbehandlung und Tötung der Ratten zu diesem Zweck. Es kann für Rezeptorbildungstests im Bereich der Reproduktionstoxikologie gut eingesetzt werden.

Prof. Adrian Smith, Sekretär von NORECOPA (der Norwegian Concensus Platform for Replacement, Reductions and Refinement of Animal Experiments) stellte Berichtrichtlinien unter dem Namen PREPARE vor, die die Planung von Tierversuchen unterstützt. Demnach ist die oft kritisierte Unzulänglichkeit der in-vivo-Forschung durch schlechtes experimentelles Design und ungenügende statistische Analysen, einen unzureichenden Einsatz von Analgetika und schlechte Reproduzierbarkeit bedingt. Deshalb haben der Autor und sein Team eine Checkliste erarbeitet, durch die sich der Forscher vor Beginn der Planung durcharbeiten muss. In die Richtlinien sind die Erfahrungen der letzten 30 Jahre bei der Planung und Überwachung von Tierversuchen eingeflossen. PREPARE erinnert mit 15 Punkten an notwendige Literaturrecherchen, zu klärende Rechtsfragen, Aspekte der Schaden-Nutzen-Analyse ebenso wie Aspekte, die die Kommunikation mit der Tierschutzbeauftragtem und die Qualitätskontrolle anbelangt. PREPARE ist mittlerweile in 17 Sprachen übersetzt worden und kann von der NORECOPA Website kostenlos heruntergeladen werden. Ebenso bietet die Plattform eine Datenbank und Links zu allen 15 Checklistenpunkten.

Da Publikationen immer nur die positiven Tierversuchsergebnisse widerspiegeln werden Folgetier-Versuche auf einer falschen Grundlage geplant (Publikationsbias).  Mit einer Vorregistrierung von Tierversuchen sollen Reproduzierbarkeit und Qualität erhöht werden.  Nachwuchswissenschaftlerin Mira van der Naald vom Department of Cardiology des University Medical Centers in Utrecht stellte hierfür eine Plattform vor. Wissenschaftler sollen sich registrieren, bevor sie einen Tierversuch durchführen. Das Ziel ist, Doppelungen bei den Tierversuchen zu vermeiden, indem in der Datenbank ggfs. bereits durchgeführte Tierversuche zu diesem Thema gefunden werden können. Lediglich Tierversuchsdurchführende können sich registrieren und werden von der Expertengruppe freigeschaltet. Eingegeben werden Hypothese, Studiendesign, primäre und sekundäre Ergebnis-messungen, Maßnahmen zur Verringerung der Verzerrung und Stichprobenumfang. Die Protokolle können sofort oder nach einer Sperrfrist freigegeben werden.

An der Justus-Liebig-Universität Gießen ist ein interdisziplinäres 3R-Zentrum gegründet worden, es heißt ICAR3R. Geleitet wird es von Prof. Stefanie Krämer (Refinement) und Prof. Peter Jedlicka (Replacement, in silico). Mit dem Zentrum sollen der Tierschutz in der biomedizinischen Forschung und Konzepte zur Entwicklung von alternativen Untersuchungsverfahren und Haltungsbedingungen entwickelt werden. Es wird die Strategie verfolgt, die mit den 3R assoziierten Wissenschafts-disziplinen, die Refinement, Reduktion und Replacement repräsentieren, zu vernetzen (Interdisziplinarität).  Das Auftaktsymposium ist vom 18. bis 19. Oktober 2018.

Neues von der Europäischen Kommission und darüber hinaus

Die Europäische Kommission ist noch immer damit beschäftigt, zu untersuchen, ob die europäische Direktive EU/63/2010 in den Mitgliedsstaaten richtig umgesetzt wurde. Für die Art der Umsetzung lasse die Tierversuchsrichtlinie Freiraum, so Dr. Susanna Louhimies. Jedoch brauche es mehr Erfolg und Zusammenarbeit bei der Harmonisierung. Die alle drei bis fünf Jahre erscheinende europäische Tierversuchsstatistik soll durch jährlich erscheinende zusammenfassende Analysen (summary analyses) abgelöst werden, damit nicht mit veralteten Daten gearbeitet werden muss. Zudem wird es eine zentrale EU-weite Datenbank mit nicht-technischen Projektzusammenfassungen (NTPs) in jeder Sprache der Mitgliedsländer geben. Um dessen Qualität zu verbessern, will das Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) mit Anleitungsvideos die Qualität der NTPs verbessern.

Auf einem Workshop des ECVAM-Stakeholderforums (ESTAF) im November soll  eine mögliche Validierung von mikrofluidischen Systemen besprochen werden.

Dr. Erin Hill vom Institute of In vitro Sciences (IIVS) informierte darüber, dass die Food and Drug Administration (FDA) der USA eine neue Roadmap für Tests von Medizinprodukten entwickelt hat. Das Programm heißt Medical Device Development Tool (MDDT). Laut Bericht wollen die Regulatoren von Medizinprodukten mehr humane Vorhersage-modelle zum Einsatz bringen, wobei dreidimensionale Zellkulturmodelle nicht besser seien als Tierversuche. Vom Vorzug würden daher mikrophysiologische Systeme in Kombination mit in silico- und in vivo-in vitro-Extrapolationen gegeben. In der Praxis würden die neuen Methoden bei der Zulassung von den Regulationsbehörden jedoch nicht immer akzeptiert.